聚合酶链式反映（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体表的特殊DNA复造，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增长 。
你在做PCR尝试的时辰遇到过哪些问题？来看看前辈们的经验 。
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没有ct值
检测了局遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:
1、循环数不够(通常不超过45循环,不仅布景值提高,定量也禁绝);
2、PCR法式设置谬误,检测荧光信号的步骤有误 。通常SG法选取72℃延长时采集,TaqMan法令通常在退火实现时或延长时采集信号,另表荧光采集是否选中;
3、引物或探针降解 ？赏ü齈AGE电泳检测引物和探针是否降解;
4、模板量可能降解或上样量不及(不超过500ng,凭据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;若是产生模板降解,应试虑样本筹备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本幼量分装储蓄,预防反复冻融;
5、引物探针是否相宜(尤其是引物逾越内含子,以确保扩增基因组DNA;高低游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增) 。
ct值过晚
在相对定量中, Ct值通常节造在15—25之间比力好,若是在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是通常不宜超过40循环, 不然定量不正确 。
因而,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 必要凭据具体尝试设计和主张进行 。
1、扩增效能低 。引物之间或者引物和探针的比例不相宜, 必要进行优化;引物或探针设计不合理, 必要沉新设计;
2、PCR法式不相宜, 改用三步法进行反映, 或者优化退火/延长温度, 能够适当降低退火温度; 退火/延长功夫短(能够在推荐的功夫前提下耽搁10s);
3、MgCl2浓度不相宜,增长镁离子浓度等 。PCR各类反映成分的降解或加样量的不及;
4、PCR产品太长 。PCR产品设计超过500bp;
5、模板中存在抑造物 。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释 。
阴性对照扩增有信号
照扩增有信号排查各操作环节是否有不当,造成交叉传染:
1、引物设计不够优化 。应预防引物二聚体和发夹结构的出现 。
2、引物浓度欠安 。适当降低引物浓度,并把稳高低游引物的浓度配比 。
3、镁离子浓度过高 。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的mix试剂盒 。
4、模板有基因组的传染 。RNA提取过程中预防基因组DNA的引入,或通过引物设计预防非特异性扩增 。
5、交叉传染 。在所用的试剂中有交叉传染, 或操作环境中有气溶胶造成传染, 建议对操作环境进行处置, 或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等 。
尺度曲线欠安
尺度曲线线性关系欠安R2<0.9,很有可能是以下环节存在问题:
1、尺度品稀释或者加样误差,使得尺度品不呈梯度;
2、尺度品出现降解 。应预防尺度品反复冻融,将高浓度DNA模板分装,保留于-20℃或-80℃,现配现用;
3、引物或探针欠安 。沉新设计更好更不变的引物或探针;
4、模板中存在抑造物 。模板浓度过高,凭据现有商品化荧光定量试剂盒的要求,通常模板量以50—500ng为宜 。
熔解曲线峰不特异
熔解曲线峰不特异很有可能是以下环节存在问题
1、引物设计不够优化 。应预防引物二聚体和发夹结构的出现; 引物浓度欠安, 尤其是涉及二聚体存在时, 适当降低引物浓度, 并把稳高低游引物的浓度比例;
2、模板有基因组传染 。RNA提取过程中预防基因组DNA的引入, 或通过引物设计预防非特异性扩增 。
3、离子浓度不相宜 。适当降低镁离子浓度, 或选择更适合的mix试剂盒, 分歧试剂盒在该方面的优化能力不适合, 有些情况下能够通过更换试剂盒改善了局;
扩增曲线异常
遇到扩增曲线异常,好比“S”型曲线等等情况,有可能是以下环节存在问题:
1、模板的浓度太高或者降解;
2、荧光染料的降解;
3、在操作荧光定量PCR时,带上新的一次性手套,盖上预防任何指纹或者字迹等;
4、液体挥发 。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的荟萃在管子里;
5、气泡 。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题 。
扩增效能低
该情况合用于针对所有的基因,出格是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时,应试虑如下情况:
1、反映试剂中部门成分比例是否最佳,另表思考荧光染料是否降解;
2、反映前提不够优化 ？墒实苯档屯嘶鹞露然蚋奈嚼┰龇,适当耽搁变性退火功夫;
3、反映系统中有PCR反映抑造物 。通常是参与模板时所引入的,应先把模板适度稀释,再参与反映系统,削减抑造物的影响 。????
